وبلاگ

لوان یا پلی فروکتوز اگزوپلی ساکارید متشکل از واحد های فروکتوزی است(ارناندز و همکاران،2005) [1] که دارای وزن مولکولی 107 دالتون و حدودا از 1470000 واحد فروکتوز تشکیل شده است که در اثر آنزیم لوان سوکراز در خارج از سلول باکتری تولید میشود(آلرگر و همکاران،2006)[2]. گیاهان گلدار لوان را در واکوئل های خود به عنوان منبع قندی برای سازگاری با شرایط سرما و خشکی ذخیره می شود اما در باکتری ها نقش تامین کننده منبع انرژی را ایفا می کند.(با نگئولا و همکاران،2006)[3] برخی باکتریها از قند سوکروز به عنوان منبع کربن استفاده میکنند و در نتیجه قادر به تولید آنزیم فروکتوزیل ترانسفرازهستند(شاشیکالا و همکاران،2001)[4].آنزیم فروکتوزیل ترانسفراز دارای 2 سوبسترا 2،6 بتا – دی فروکتوزیل و سوکروز است که طی واکنش گلیکوزیل ترانسفراز 2 محصول گلوکز و 2،6 بتا – دی فروکتوزیل را تولید می کند(شاشیکالا و همکاران،2001).

 

   آنزیم فروکتوزیل ترانسفراز یک آنزیم خارج سلولی با وزن مولکولی 480 دالتون که سبب تسریع انتقال واحد فروکتوزیل به تعدادی از پذیرنده ها از جمله ساکاروز ،آب و پلیمر فروکتان می شود(شاشیکالاوهمکاران،2001؛با نگئولا و همکاران، 2006؛ارناندز و همکاران،2005). فعالیت این آنزیم در گستر ه های از فرایند ها شامل بقای باکتری در خاک (باسیلوس سوبتلیس) فتو پاتوژنسیس (اروینیا و سودوموناس) همزیستی (باسیلوس پلی میکسا) و متابولیسم فروکتان در گیاهان است(هرناندز و همکاران،1995) [5]. این آنزیم در باکتریهایی همچون ژئو باسیلوس استرئوترموفیلوس ،باسیلوس سرئوس،لاکتو باسیلوس رئوتری،لوکونوستوک مزانتروئید،استرپتوکوکوس سالیویروس، باسیلوس پلی میکسا ومخمرهای همچون آسپرژیلوس و رودوترولا و قارچ تولید می شود(بنتینگ و همکاران،2001)[6]. این آنزیم در صنایع مواد غذایی و داروسازی و همچنین در تشخیص بیماری دیابت و پاتوژنز بیماری پریودنتال استفاده می شود (پابست و همکاران، 1997؛ آلگر وهمکاران، 2004) [7].

 

در این تحقیق استفاده از نمونه های محیطی نه تنها سبب استخراج آنزیم مورد نظر بلکه هم در وقت و هم در هزینه صرفه جویی می شود و راندمان تولید به مراتب بیشتر خواهد شد.

 

1-1 پرسش اصلی تحقیق

 

1. آیا امکان جداسازی باکتریهای مولد آنزیم فروکتوزیل ترانسفراز از نمونه های محیطی وجود دارد؟

 

1. آیا باکتریهای استخراج شده آنزیم مورد نظر را دارند؟

 

1. آیا پتانسیل مناسبی جهت تولید آنزیم فروکتوزیل ترانسفراز در باکتریهای محیطی وجود دارد یا خیر؟

1-2 فرضیه ها

 

1.پتانسیل تولید آنزیم ترانسفراز در باکتریهای محیطی در حضور بقایای گیاهی وجود دارد.

 

2.میزان تولید آنزیم بسته به میزان سوبسترا و دمای محیط متفاوت است

 

1-3 اهداف تحقیق

 

1.جداسازی باکتریهای مولد آنزیم فروکتوزیل ترانسقراز ازنمونه های محیطی

 

2.شناسایی مولکولی و تعیین سکانس ایزوله های موثر در تولید آنزیم

 

3.هدف کاربردی : ایجاد دانش فنی تولید آنزیم فروکتوزیل ترانسفراز

 

1-4 فروکتوزیل ترانسفراز میکروبی

 

فروکتوزیل ترانسفراز های میکروبی، پلی مرهایی هستند که در بیوسنتز فروکتان میکروبی (لوان، اینولین، و اولیگوساکارید-قندمیوه ای) ، نقش دارند) هرناندز و همکاران،2008) [8]. از نظر ساختاری، فروکتوزیل ترانسفراز میکروبی، دامنه ی کاتالیزوری خانواده ی گلیکوزید هیدرولیز 68 را به اشتراک می گذارند و در هفت گروه که از نظر فیلوژنتیک به هم مربوط می شوند، گروه بندی می گردند(هرناندز و همکاران،2008). ژن های کدگذاری شده ی فروکتوزیل ترانسفراز در اپرون ها یا گروه های مرتبط با سایر ژن هایی سازمان دهی می شوند که به ترشح متابولیسم کربوهیدرات یا فروکتوزیل ترانسفراز ارتباط دارند (هرناندز و همکاران،2008).بروز ژن فروکتوزیل ترانسفراز ، عمدتا توسط سیستم های دوجزئی یا مکانیزم های فسفریلاسیون تنظیم می شوند که به دسترسی سوکرز یا سایر سیگنال های محیطی پاسخ می دهند(هرناندز و همکاران،2008). فروکتان های میکروبی، در ایجاد مقاومت در مقابل فشار محیطی مانند بی آبی، جذب مواد غذایی، تشکیل بیوفیلم و عوامل ویرولانس، نقش دارند(اهرناندز و همکاران،2008). در نتیجه اهمیت صنعتی و بیولوژیکی فروکتان ها، فروکتوزیل ترانسفراز ، موضوع تحقیقات فراوانی بوده است که برای بهبود فعالیت آنزیمی یا مشخص کردن نقش بیولوژیکی آنها در طبیعت، انجام شده اند(هرناندز و همکاران،2008).

 

   لوان سوکراز ( سوکروز 2,6 β-D فروکتان 6, β-D فروکتوزیل ترانسفراز)،از باکتریهای گرم-مثبت همچون باسیلوس.سابتیلیس، باسیلوس.ناتو،باسیلوس.پلی میکسا، باسیلوس. استرپتوکوکوس. موتانس، استرپتوکوکوس. سالیواروس، اکتینومایسس.ویسکوس،اکتینومایسس.نیوزلندی وگرم-منفی همچون اروینیا. آمیلوورا، زایموموناس. موبیلیس، استوباکتر.ساب اکسیداز،گلوکونوباکتر. اکسیداز،پانتوا.آگلومرانس، قارچ های همانند آسپرژیلوس و رودوترولا جدا شده است(دونا و همکاران،1999)[9].

 فروکتوزیل ترانسفراز 4 واکنش را کاتالیز میکند،تبدیل،هیدرولیز،ترانسفروکتوزیل،پلیمریزاسیون(هرناندزوهمکاران،2008). فروکتوزیل ترانسفراز سبب تسریع انتقال واحد فروکتوزیل به تعدادی از پذیرنده های مختلف مانندآب در واکنش هیدرولیز سوکروز، گلوکز در واکنش تبادل، سوکروز یا فروکتان در پلی مریزاسیون استفاده می کند (شاشیکالا و همکاران،2001). این آنزیم دارای 3 ویژگی 1: سنتز لوان از سوکروز از طریق واکنش ترانس فروکتوزیلاسیون 2: هیدرولیز لوان به مونوساکارید فروکتوز 3: تبدیل فروکتوز به گلوکز (شاشیکالا و همکاران،2001).

 

فروکتوزیل ترانسفراز دارای 2 سوبسترا سوکروز و 6,2 β-D فروکتوزیل که طی واکنش گلیکوزیل ترانسفراز 2 محصول گلوکز و 6,2 β-D فروکتوزیل را تولید می کند(شاشیکالا و همکاران، 2001). این آنزیم دارای وزن مولکولی 480 کیلو دالتون است و فعالیت این آنزیم در گستره های از فرایندهایی شامل بقای باکتری در خاک (باسیلوس.سابتیلیس) فتوپاتوژنسیس (اروینیا و سودوموناس) همزیستی (باسیلوس .پلی میکسا) و متابولیسم فروکتان در گیاهان است (هرناندز و همکاران،1995).

 

1-5 فروکتان ها

 

فروکتان های میکروبی، از باکتری های گرم-مثبت و گرم-منفی، قارچ های خانواده ی آسپرژیلوس[10] و رودوترولا[11]، جدا شده اند(دونا و همکاران،1999). چندین تحقیق خوب در مورد متابولیسم فروکتان گیاهان و نقش فیزیولوژیکی آنها، نقش های سودبخش به عنوان پروبیوتیک ها در تغذیه انسان و حیوان، کاربردهای صنعتی و بیوسنتزدر گیاهان ترانس ژنتیک، تا کنون به چاپ رسیده اند( هان،1990؛ویجن و اسمیکنز،1999؛دلزن و همکاران، 2005)[12]. فروکتان ها بر طبق نوع اتصالی که زنجیره ی فروکتوزیل β-D گسترده شده با سوکرز تشکیل می دهد، به عنوان اینولین ها، لوان ها(فلینز در گیاهان)، لوان های ترکیبی(گرامینان در گیاهان) و سریهای جدید(اینولین جدید و لوان جدید در گیاهان)، طبقه بندی می شوند(شکل 1) (هرناندز و همکاران،2008). اینولین ها، پلیمرهای خطی از فروکتوز با اتصال هستند( فاوکیا و همکاران،2009)[13]. افزودن باقی مانده های فروکتوزیل در اتصال به سوکرز، منجر به تشکیل کستوز-1 می شود که یک اینولین اولیه می باشد(هرناندز و همکاران،2008). پلیمرهای اینولین گیاهی، درجه ای از پلی مریزاسیون(DP)30 تا 150 باقی مانده های فروکتوزیل را دارند درحالی که اینولین های میکروبی، DP معادل با 20 تا 10000 را دارا هستند (هیجوم و همکاران،2006)[14]. لوان ها نیز پلیمرهای خطی از فروکتوز هستند اما با اتصالات (هرناندز وهمکاران، 2008). لوان دارای وزن مولکولی 107 کیلو دالتون و حدودا از 1470000 واحد فروکتوز تشکیل شده است که در اثر آنزیم لوان سوکراز در خارج از سلول باکتری تولید می شود(خنافری و همکاران، 1389).گیاهان گلدار لوان را در واکوئل های خود به عنوان منبع قندی برای سازگاری با شرایط سرما و خشکی ذخیره میکنند اما در باکتری ها نقش تامین کننده منبع انرژی را ایفا می کند( خنافری و همکاران 1389). افزودن باقی مانده فروکتوزیل به سوکرز با اتصال ، منجر به تشکیل کستوز-6 می شود که اولین ماده ی واسطه بیوسنتز لوان می باشد(هرناندز و همکاران،2008). لوان هایی که مبدائ گیاهی دارند(فلین ها)DP کوچکتر از 100 برای باقی ماندهی فروکتوزیل دارند، درحالی که لوان های میکروبی، DP بزرگتر از 100 دارند(هرناندز و همکاران 2008). لوان های ترکیبی(گرامیان ها)، ریشه ی گیاهی دارند و دارای باقی مانده ی فروکتوزیل متصل شده ی و می باشند (هرناندز و همکاران، 200). پیشگام لوان های ترکیبی، تتراساکارید بیفرکوز می باشد(شکل1) (هرناندز و همکاران،2008). در سری های جدید اینولین، واحدهای فروکتوزیل β-D، همانند اینولین، توسط اتصال به هم وصل شده اند، اما زنجیره های فروکتوزیل، به C1 یا C2 از نیمه گلوکزی سوکرز متصل هستند( لویس 1933)[15]. چنین اتفاقی برای سری های جدید لوان نیز رخ می دهد که در آن، واحدهای فروکتوزیل β-D، توسط یک اتصال به هم وصل شده اند و زنجیره های فروکتوزیل به C1 یا C6 از نیمه گلوکزی سوکرز، متصل هستند (هرناندز و همکاران،2008). چون سوکرز پیشگامِ همه ی انواع فروکتان ها می­باشد، آنها اغلب در یک سمت، نیمه گلوکزی دارند(هرناندز و همکاران،2008). زنجیره ی کوچک اولیگوساکاریدها (DP )، اولیگوفروکتوزید، فروکتواولیگوساکارید(FOS) یا زنجیره ی کوتاه FOS نام دارند(هرناندز و همکاران،2008).

 

 شکل 1-1 طبقه بندی انواع فروکتان ها بر اساس نوع اتصال زنجیره β-D فروکتوزیل با سوکروز( هرناندز و همکاران 2008)

 

 1-6 بیوسنتزفروکتان میکروبی

 

گیاهان حداقل به دو فعالیت آنزیمی مجزا احتیاج دارند تا واکنش های اولیه و مدت دار در بیوسنتزرا کاتالیز کنند(هرناندز و همکاران،2008). در مقابل، بیوسنتز فروکتان ها، نیازمند یک فعالیت فروکتوزیل ترانسفراز برای هردو واکنش می باشد(هرناندز و همکاران،2008). فروکتوزیل ترانسفرازهای بر طبق روال روبرو دسته بندی شده اند: (1)نوع اتصال میان واحدهای فروکتوزیل β-D در پلیمر که سنتز می کنند (2) ویژگی آنزیمی خود(هرناندز و همکاران،2008). فروکتوزیل ترانسفرازهای ، یک باقی ماندهی فروکتوزیل را به یک مولکول پذیرنده ی سوکرز انتقال می دهند که این عمل بر طبق واکنش کلی می باشد:

 

O- β – D – fructofuranosyl – (2 – 1)- -αD-glucopyranoside +) β -D- fructofuranosyl -( n

 

– β -D-fructofuranosyl-(2 -1)- -α-D-glucopyranoside) = o- -α D – glucopyranoside – + (β -D

 

-fructofuranosyl–( n+1 – β – D – fructofuranosyl-(2 – 1)- -αD- glucopyranoside

 

   برای لوکونوستوک مزانتروئید B-512FMC ، یک استثنا رخ می دهد که به جای سوکرز، از مالتوز، به عنوان مولکول پذیرنده استفاده می کند که ارلوز(erlose) تری ساکارید اولیه را تشکیل می دهد(کانگ و همکاران 2005)[16] . استثنای دیگر در مورد باسیلوس مگاتریوم می باشد که بتا دی ساکارید β-D فروکتوفرانوزیل گلوکوپرانوزید را سنتز می­ کند(هومان و همکاران،2007)[17]. لوان سوکرازها به بهترین شکل، فروکتوزیل ترانسفرازهای را توصیف می کنندو اغلب لوان های میکروبی توسط انتقال یک باقی مانده­ی β-D فروکتوزیل        به مولکول پذیرنده(سوکرز یا لوان) با اتصال های (2-6)، سنتز می کند(هرناندز و همکاران 2008). لوان سوکرازهای میکروبی، از گیرنده های مختلفی استفاده می کنند، مانند آب(در واکنش های هیدرولیز سوکرز)، گلوکز(در واکنش های متناوب) و سوکرز یا فروکتان (در واکنش های پلیمریزاسیون). لوان سوکرازِ  راهنلا.آکوآتیلیس JMC1683، نیز از D – زیلوز، D -آرابینوز ، L -آرابینوز، لاکتوز، مالتوز، مالتوتریوز، سلوبیوز و ملی بیوز، به عنوان پذیرنده استفاده می کند(هرناندز و همکاران 2008). لوان سوکراز باسیلوس سابتیلیس NCIMB11871، از حداقل 10گلیکوپرانوزید متفاوت و چندین دی ساکارید به عنوان پذیرنده استفاده می کند(سیبل و همکاران،2006)[18]. ویژگی های جنبشی عمومی آنزیم های لوان سوکراز، در جدول شماره ی 1 توضیح داده شده اند.اغلب لوان سوکرازها، آنزیم های مونومری با وزن مولکولی 46-73kDa دارند(هرناندز و همکاران،2008).راهنلا.آکوآتیلیس، لوکونوستوک.مزانتروئید و اکتینومایسس.ویسکوس که دیامر تشکیل می­دهند، بیشترین وزن مولکولی را دارا هستند(پابست،1977؛اهتسوکا و همکاران، 1922؛کانگ و همکاران،2005)[19].

 

PI   برای لوان سوکرازها ، بین 2.6 تا 5.5 متغیر می باشد، در حالی که مقادیر pH بهینه، از 5.0 می باشد تا 6.2. مقادیر Km گزارش شده برای سورکرازلوان ها، از 4.0 تا 160 مول به توان منفی یک می باشد(جدول شماره یک) (هرناندز و همکاران،2008). یون های آهن، به عنوان کوفاکتورها تنها برای لوان سوکراز های لاکتوباسیلوس رئوتری[20]، لوکونوستوک. مزانتورئید[21]، همچون باسیلوس سابتیلیس[22] که نیازمند Ca2+ هستند، گزارش شده است و برخی از گونه های باسیلوس. سابتیلیس به جای +Ca2، نیازمند +Fe3هستند(ون هیجوم و همکاران،2004؛ازیمک و همکاران،2005؛ ملارس- آریتا و همکاران،2006؛گای و همکاران،1983) [23]. فعالیت فروکتوزیل ترانسفراز در لوان سوکراز ، توسط یک مکانیزم واکنش پینگ پنگی(رفت وبرگشتی) رخ می دهد که، در باسیلوس. سابتیلیس، گلوکوناستوباکتر دیازوتروفیکوس[24] و استرپتوکوکوس سالیواریوس[25]، تایید شده است(چامبرت و همکاران،1974؛هرناندز و همکاران،1955؛ سونگ و جاکوس،1999)[26].

 

اینولوسوکرازها، باقی مانده های فروکتوزیل β-D را به پذیرنده های سوکرز یا اینولین با اتصالات( ) انتقال می دهند(هرناندز و همکاران 2008).اگرچه اینولین یک فروکتان گیاهی مشخص و نمونه ای است، اما لاکتوباسیلوس. رئوتری، لوکونوستوک سیترئوم[27] و استرپتوکوکوس موتان[28] نیز، فعالیت های اینولوسوکراز از خود نشان می دهند(هیجوم و همکاران، 2002؛اولیور- ایلانا و همکاران،2003؛ابیسو و همکاران، 1975)[29].وزن های مولکولی اینولوسوکراز از لاکتوباسیلوس.رئوتری و لوکونوستوک. سیترئوم 85 و 170کیلو دالتون، PI آنها4.5 و 5.0، pH بهینه آنها 5.0 . 6.5 و Km آنها برای سوکرز به ترتیب 21.0 و 66.0 مول می باشد(هرناندز و همکاران،2008). برای اینولوسوکراز استرپ. موتان، هیچ مشخصه جنبشی، گزارش و ثبت نشده است(هرناندز و همکاران،2008). مکانیزم های واکنش برای اینولوسوکرازها مشخص نشده اند و گزارشی مبنی بر استفاده از آب یا گلوکز به عنوان پذیرنده های فروکتوزیل جایگزین، ارائه نشده است(هرناندز و همکاران،2008).

 

   همچنین، فروکتوزیل ترانسفرازهای ، سنتز لوان را نیز کاتالیز می کند اما آنها هیدرولیز را کاتالیز نمی کنند یا مانند لوان سوکرازهای ، واکنش ها را تبادل نمی کنند(هرناندز و همکاران،2008). ویژگی های جنبشی فروکتوزیل تراسنفراز ، در جدول شماره 1، فهرست شده اند. وزن های مولکولی مابین 75 و 180 کیلو دالتون، pH بهینه 4.5-7.5، و مقادیر km برای سوکرز، 5.0-770.4 مول می باشند(هرناندز و همکاران،2008). آنزیم های رودوترولا LEB-V10 و آسپرژیلوس آکولئاتوس، از نوع دیمری می باشند(قاضی و همکاران،2007؛ هرنال استینس و مایوگری،2008)[30]