وبلاگ

نوترکیبی همسان فرایندی است که در آن میتوان به تحریک ژنهای خاصی اقدام نمود که در نهایت با عملکرد جدید این ژنها میتوان یک ارگانیسم را به تولید یا عدم تولید یک پروتئین خاص وادار نمود. در حال حاضر تحقیقات گوناگونی وجود دارد که در آنها از نوترکیببی همسان استفاده می­ شود. هرچقدر این روشها بهینه­تر گردند، مسلما فرایندهای اقدامات آزمایشگاهی را تسهیل خواهد نمود، در نوترکیبی همسان قطعه ای از محصول PCR به داخل کروموزوم باکتری وارد شده و با بهره گرفتن از وکتورهای λ-Red قادرخواهیم بود که ژن recA را در میزبان تحریک کرده ونوترکیبی همسان را به انجام برسانیم. درمطالعات قبلی نشان داده شده است که طول توالی­های انتهایی (flank) دو سر انتهای محصولPCR نقش مهمی در انجام نوترکیبی همسان دارد، ولی انتخاب طول flank طبق قاعده و قانون خاصی نیست و محقق باید بصورت آزمون و خطا این طول را انتخاب نماید. در مطالعات انجام شده بر سویه های استاندارد، طول این flank میتواند از 50 تا 2000 جفت باز متغیر می باشد.

 

در این مطالعه ابتدا باکتری های استاندارد dysentrieae Shigella,E.coli, Vibrio Cholerae در محیط غذایی کشت داده می­ شود و سپس کلنی مساوی از هر یک از باکتری ها را انتخاب و جهت استخراج totalRNA به کار میرود. پس از تهیه total RNA آن را تبدیل به total cDNA می کنیم،. جهت تعیین وارزیابی بیان ژن l-Red از تکنیک Real-timePCR با بهره گرفتن از SYBR greenІ و روش Relative استفاده نموده و میزان بیان ژنهای l-Red را در هر میزبان به دست خواهد داد. ژنهای l-Red ومیزان بیان آن در میزبان های متفاوت متغیر بوده و قطعا با ارزیابی بیان آن
می توان تا حدود زیادی طول مناسب را جهت نوترکیبی همسان تعیین کرد. در آن پایان نامه تلاش میگردد تا فرایند انجام نوترکیبی همسان در سویه های باکتری dysentrieae Shigella,E.coli, Vibrio Cholerae را تسهیل نمود. به عبارتی قرار است بررسی گردد آیا نتایج بدست آمده باعث کمک به بهبود فرایند نوترکیبی همسان میشود یا خیر؟ و واضح است که هر چه میزان بیان ژنهای l-Red بیشتر باشد، بازده نوترکیبی همسان با طول کمتر flank نیز میسرتر است.

 

واژگان کلیدی: نوترکیبی همولوگ، ژن l-Red، dysentrieae Shigella,E.coli, Vibrio Cholerae

 

1-1 انتقال ژن در باکتری

 

در اكثر باكتری ها توراث ژنها اغلب به صورت عمودی است اما قسمت قابل توجهی از آن توسط انتقال جانبی یا عرضی بین باكتری ها انتقال می یابد. عناصر ژنتیكی متحرك مثل پلاسمیدها، باكتریوفاژها و ترانسپوزون ها به همراه تغییرات ژنی مثل حذف، اضافه شدن و ترتیب دوباره ژن ها سیر تكاملی پروكاریوتها را تسریع كرده اند و باعث ایجاد تغییرات در ژنوم باكتری ها و در نتیجه ایجاد تنوع ژنتیكی گردیده اند. باكتری ها با توجه به داشتن ژنوم كوچكتر نسبت به یوكاریوتها توانایی بیشتری برای به
اشتراك گذاشتن ژنوم­شان از طریق انتقال عرضی ژن توسط هم یوغی، ترانسداكشن[1] و ترانسفورمیشن[2] دارند. مهمترین فرایند هم یوغی است كه طی تمـاس مستقیـم سلول با سلول اتفاق می­افتد
(Proter 1997; Burrus 2006).

 

هم یوغی امكان تغیرات ژنتیكی بین باكتریها و گاه حتی بین سلولهای یوكاریوتی را امكان پذیر
می سازد و اغلب توسط آن ژن های موجود بر روی « پلاسمیدهای كانژوگه» منتقل می شوند. ترانسداكشن نوع دیگری از انتقال افقی ژن است كه توسط ویروس ها و باكتریوفاژها صورت می پذیرد. بعضی از باكتریوفاژها می توانند به صورت یک پروفاژ به داخل كروموزوم باكتری میزبان وارد شده و باعث لیزوژنی آن شوند. پروفاژها قسمت مهمی از اكتساب افقی ژن را در DNA بسیاری از باكتریها به خود اختصاص داده اند. گاهی اوقات باكتریوفاژها باعث انتقال قسمت های متحرك دیگری از DNA باكتری و یا قسمتی دیگر از DNA ثابت باكتری می شوند و این زمانی اتفاق می افتد كه خروج فاژ به صورت دقیق صورت نگیرد. این مرحله ترانسداكشن تخصصی [3] نامیده می شود.

 

سومین نحوه انتقال ترانسفورمیشن است كه در آن DNA آزاد از محیط برداشته میشود. برای پایدار ماندن DNA وارد شده به ژنوم میزبان طی هر سه روش احتیاج به یک سری مراحل حمایت كننده مثل نوترکیبی یکسان[4] می باشد. همگان قبول دارند كه اكتساب توالی های جدید و توسعه ژنوم امری حیاتی برای تكامل میباشند. این که آیا ژن های اكتسابی در باكتری نگه داشته می شوند و یا این كه چگونه باقی
می مانند بستگی به عملكرد آن ژنها و فشار انتخابی محیط برای نگه داشتن آن دارد .( Proter 1997)

 

1-2 ترانسفورماسیون

 

ترانسفورماسیون یکی از راه های انتقال توارث به سایر باکتریها میباشد. در این روش یک تکه DNA دو رشته ای آزاد در محیط به سطح یک باکتری دیگر متصل شده و تنها یک رشته آن وارد باکتری شده و در کروموزوم باکتری میزبان ادغام می شود. برای داخل شدن قطعه ای از DNA در درون کروموزوم، عملکرد اپرون UVrABCD (UV در اول اسم اپرون مخفف پرتو UVاست ) ژن rec A بر اثر عوامل مثل uv ، عوامل شیمیایی و ورود DNA تک رشته ای به درون باکتری فعال میشود و rABCD مخفف ژنهایrecA, recB, recC و recD میباشد) این اپرون شامل ژنهای recA, recB, recC وrecD میباشد. فرایند نوترکیبی[5] بواسطه پروتئین RecA فعال میگردد. در این فرایند، اگر DNAتک رشته ای وارد شده در باکتری، با ناحیه ای از کروموزوم تشابه داشته باشد، تعویض میگردد که این جابجایی بواسطه پروتئین RecA انجام
می پذیرد. از طرفی ژنهایrecB, recC وrecD نقش تنظیمی، با عملکرد منفی بر روی ژن recA را بازی میکنند(Hamood et al., 1986).

 

در حال حاضر، در آزمایشگاه های تحقیقاتی، با بهره گرفتن از این سیستم و نحوه ادغام فاژ λ وکتوری (وکتور ها مولکول‌های DNA ای هستند که برای کلون کردن قطعات DNA در سلول های میزبان به کار می‌روند) را تولید نموده اند که میزان نوترکیبی را در باکتریها افزایش میدهند. در این وکتور سه ژن exo, bet وgam را تحت یک پروموتری که با L-arabinose تحریک می شود قرار داده اند. عملکرد این سه ژن بدین صورت است که پروتئین Exo باعث هضم نوکلئوتیدها از قسمت 5’ انتهای DNA دو رشته ای
می­ شود و پروتئین Bet با حفاظت از قسمت تک رشته ای 3’ بوجود آمده، مانع تخریب آن میگردد. نهایتا پروتئین Gam با ممانعت از عملکرد ژنهای recB,recC وrecD باعث تحریک بیان ژن recA در باکتریها می شود (شکل1-1).

 

مارکر مقاومت آنتی بیوتیکی در این وکتور آمپی سیلین بوده و از نظر تعداد پلاسمید در باکتریها، جزء پلاسمیدهای شمارش تکرار پایین[6]محسوب میگردد. بهترین دما، برای تکثیر این وکتور 30 درجه سانتیگراد بوده و در دمای 42-37 درجه سانتیگراد از دست میرود. بنابراین از این نظر، جزء پلاسمیدهای حساس به دما[7] نیز تقسیم ­بندی میگردد (Yamamoto et al., 2009). مهمترین و کاربردی ترین پلاسمید در این زمینه pKD46 بوده که قابلیت تکثیر، در dysentrieae Shigella,E.coli, Vibrio Cholerae را دارد.

 

شکل (1-1) عملکرد ژنهای exo, bet وgam بر روی DNA دو رشته ای

 

 

 

1-3 نوترکیبی

 

نوترکیبی[8] ژنتیکی فرایندی است؛ که طی آن مولکول اسیدنوکلئیک شکسته شده و به شکل­های مختلف به یکدیگر متصل می شوند. این عمل در بیشتر مواقع مربوط به DNA و گاهی درRNA نیز دیده
می شود. نوترکیبی می تواند بین کروموزوم های همولوگ باشد که به آن نوترکیبی همسان گفته می شود. نوترکیبی به طور معمول روشی برای ترمیم DNA پروکاریوت و یوکاریوت ها می باشد که در یوکاریوت ها در میوز رخ داده و به آن فرایند کراسینگ اور می گویند. در طی آن جابه جایی کروموزوم پدر و مادری رخ می دهد و می‌تواند سبب تولید الل جدید شود. در سیستم ایمنی این فرایند نقش بسیار مهمی را ایفا می­ کند وسبب مقاومت بدن در مقابل بیماریزاهای مختلف می شود.

 

شکل( 1-2) نوترکیبی

 

نوترکیبی روشی مفید در مهندسی ژنتیک محسوب می شود. از نوترکیبی می توان جهت ایجاد تغییر در نوکلئوتیدهای ژنوم باکتری ها، ویروس ها،BACs[9]،[10]PAC و پلاسمیدها استفاده کرد. ولی لازم به ذکر است که نوترکیبی در محیط زنده[11] نیز انجام می پذیرد. بنابراین برای ایجاد چنین تغییری در ژنوم می توان از نوترکیبی همسان[12] استفاده کرد. در نوترکیبی همسان باید از محصول PCR[13] که انتهاهای آن به صورت تک رشته­ای در آمده و یا از تک رشته های DNAسنتتیک استفاده نمود. در پروکاریوت ها میزان ایجاد نوترکیبی طبیعی 10-5-10-4 می­باشد ولی میزان ایجاد نوترکیبی همسان 10-1/0 درصد می باشد. در نوترکیبی همسان مهمترین فاکتور طول قسمتهای انتهایی محصول PCR می باشد که به خاطر عملکرد محصول ژن bet صورت تک رشته ای در آمده است. هر چه میزان طول ترادف های همسان بیشتر باشد بازده ی نوترکیبی همسان بیشتر خواهد بود. پدیده ی نوترکیبی همسان به واسطه ی بیان ژنrecA در باکتری ها صورت
می گیرد. بنابراین هر چه میزان بیان ژن recAبیشتر باشد بازدهی نوترکیبی همسان نیز بیشتر خواهد بود (Sharan et al.,2009). نوترکیبی همسان در باکتریها بواسطه ی حضور پر رنگ بیان ژن recA صورت
می گیرد.

 

بیان ژن recAبواسطه ی اپرون recBCD. (اپرون واحد عملکرد DNAژنومی است که شامل مجموعه‌ای از ژن‌های تحت کنترل یک سیگنال نظارتی یا پروموتر است) کنترل و سرکوب می­گردد تا از بیان افسار گسیخته ی آن جلوگیری شود. کاهش بیان ژن recA باعث کاهش میزان نوترکیبی می گردد. در نتیجه برای افزایش بازدهی آن به تحریک بیان ژن recA به عنوان کلید حل این معما استفاده کرد
(Murphy et al., 2000).

 

سیستم نوترکیبی مبتنی بر λ–Red در تغییر ژن ها بسیار سودمند میباشد. شیوه های ساده ای برای غیر فعال سازی و تغییر ژنها و نوکلئوتیدها در باکتریها با بهره گرفتن از تکنیک بازسازی ژنتیکی سلول وجود دارد، این امر با کمک سیستم نوترکیبی λ–Red و محصول PCR حامل یک کاست مقاومت انتی بیوتیکی روی کروموزوم باکتری صورت می گیرد و هر چه طول انتهای همولوگ بیشتر باشد، بازدهی نوترکیبی همسان بیشتر خواهد بود (Yamamoto et al., 2009).

 

نوترکیبی همولوگ در ترمیم DNAآسیب دیده در حین همانندسازی DNA موثر است. در سلول­های یوکاریوتیک میزان نوترکیبی همسان 8-16 درصد گزارش شده است(Saleh Gohari et al., 2005). مطالعات نشان داد که نوترکیبی همسان در باکتری , Vibrio Choleraeباعث ایجاد سویه های زنده ضعیف شده می گردد. ژنهای mer،ctxB،hlyA بواسطه نوترکیبی همسان دگرگون شده و باکتری های وحشی تبدیل به سویه های کاربردیCVD109 گردیدند. در این پروسه توالی­های یکسان انتهایی با طول­های متفاوت 100،500،1000 نوکلئوتیدی بررسی شده (Michalski et al.,1993). نهایتا مقالات و گزارشات نشان می دهد که هر چه میزان بیان ژن recA بیشتر باشد، بازدهی نوترکیبی همسان نیز بیشتر خواهد بود. ولی نکته مهم این است که میزان بیان ژن recA در باکتری های متفاوت نیزاختلاف نسبتا جزئی دارد، بنابراین ارزیابی و سنجش بیان ژن recA در بهبود و افزایش بازدهی نوترکیبی همسان مفید واقع خواهد شد و برهمگان واضح است که فرایند نوترکیبی همسان برای ایجاد واکسن و سویه های زنده ضعیف شده و همچنین ارزیابی ژنهای کنترلی مفید خواهد بود.

 

1-4 تعریف PCR[14]

 

این تکنیک در اواسط دهه­ 1980 بوسیله ی کری مولیس معرفی شد. به دلیل کاربردها و مزیت­های بسیار زیاد آن به سرعت در زیست شناسی مولکولی گسترش پیدا کرد. امروزه این روش تقریباً در تمامی آزمایشگاه ها ی زیست مولکولی جزو کارهای متداول می باشد و به صورت اتوماتیک بوسیله­ کامپیوتر انجام می شود.این تکنیک تمامی مشکلات قبلی در زیست مولکولی که ناشی از عدم دسترسی به مقادیر زیاد از DNA یکسان بود را برطرف کرد. برای مثال قبلاً برای بدست آوردن نسخه­های متعدد از یک ژن خاص می بایست این ژن را به داخل حامل مناسب وارد کرده و در یک باکتری تکثیر کنند ولی امروزه این کار را به سادگی و با بهره گرفتن از PCRانجام می دهند. PCR به معنی واکنش زنجیره ای پلی مراز می باشد. هدف از آن سنتز رشته هایDNA   جدید از روی رشته های الگو است که به صورت زنجیر وار تکرار
می­ شود. PCR دارای انواع متعددی می باشد که یکی از آنها Real TimePCRاست. دراین روش از ژل آگارز استفاده نمی شود و امروزه با دستگاه های به نام لایت سایکلر[15] که مقدار محصول در هر سیکل را نمایش می دهد بسیار ساده شده است. در ساده ترین حالت از اتیدیوم بروماید[16] به عنوان رنگ تداخلی با DNA برای تعیین مقدار محصو ل تولید شده در هرسیکل می توان استفاده کرد. ازآنجایی که قابلیت فلورسانس اتیدیوم بروماید در حضور DNA دورشته ای افزایش می یابد، می توان از آن برای تشخیص وتعیین مقدارمحصول دورشته ای استفاده کرد. اتیدیوم بروماید تقریبا هیچ گونه اثری برروی مقدارو خصوصیات واکنش های PCR، ندارد بنابراین تکثیر توالی های خاص DNA وتشخیص همزمان آن با دستگاه ترانس ایلومیناتور فرابنفش[17] امکان پذیر می گردد.

 

PCR از نظر اصول عملی تشابه زیادی به همانند سازی DNA دارد و در واقع برگرفته از آن است . یاد آوری می شود که DNA پلیمراز DNA تک رشته ای را از جهت  5َ به  3َ به عنوان الگو مورد استفاده قرار می دهد ورشته مکمل را در جهت5َبه 3َمی سازد. همچنین DNA پلیمراز برای شروع احتیاج به یک قطعه اولیه (شناساگر) دارد.

 

برای انجام PCR ، DNAپلیمراز ، نوکلئوتید تری فسفات ها و پرایمر لازم هستند. از آنجائیکه DNA دو رشته ای است، دو نوع پرایمر درPCR موردنیاز است. این دو پرایمر دو عمل انجام می دهند، اول اینکه محل ژنی که باید تکثیر شود را مشخص می نمایند و دوم اینکه اندازه ی قطعات تکثیر شونده را تعیین
می کنند . عمل اول کاملاَ مشخص است، در مورد عمل دوم باید گفت که وقتی این دو شناساگر به دو ناحیه­ی مختلف DNA و به سمت هم قرار می­گیرند DNA پلیمراز تنها قطعات را در بین این دو ناحیه همانندسازی می­ کند و به این ترتیب طول قطعات ساخته شده تعیین می­ شود. برای شروع PCR ، DNA الگو، پرایمر ها و نوکلئوتید تری فسفات ها و DNA پلیمراز در یک لوله با هم مخلوط می شوند. سپس لوله را گرم می کنند تا دو رشته DNA از هم جدا شوند. سپس لوله را سرد می کنند تا پرایمر ها به نواحی مورد نظر متصل شوند و DNA پلیمراز شروع به همانند سازی از روی DNA بنماید. بعد از مدت زمان لازم برای همانند سازی بار دیگر پرایمرها به نواحی مکمل خود متصل شوند. چون در مرحله ی قبل رشته DNA در ناحیه مورد نظر مضاعف شده است، در این مرحله چهار رشته ی الگو برای همانند سازی وجود دارد و در نتیجه در پایان این مرحله بوجود می آید، و در مرحله ی بعد 16 نسخه و به همین صورت بطور تصاعدی تعداد نسخه های ژن ها زیاد می شود .

 

در ابتدای طراحی PCR از آنزیم DNA پلیمراز E.coli استفاده شد ولی این آنزیم به حرارت حساس می باشد و بنابراین پس از هر بار حرارت دادن محیط واکنش تا دمای 94 درجه­ سانتی ­گراد، افزودن دوباره­ی آنزیم تازه به محیط لازم بود. یکی از مهم­ترین کشفیات در این زمینه این بود که باکتریهای
چشمه­های آب گرم دارای DNA پلیمراز هایی هستند که نسبت به حرارت مقاوم بوده و حتی در دمای بالا فعالیت بهتری دارند . برای مثال باکتری  Thermus  aquaticus دارای DNA پلیمرازی است که در دمای 94 درجه ی سانتی گراد کاملاَ پایدار است و همچنین دمای اپتیمم عمل آن نیز 72 درجه ی سانتی گراد می باشد، این DNA پلیمراز که بطور خلاصه Taq پلیمراز نامیده می شود باعث شد که براحتی PCR به صورت اتوماتیک انجام شود و با افزودن یکبار آنزیم Taq پلیمراز دیگر نیازی به اضافه کردن مجدد آن نباشد .

 

مزیت بسیار مهم دیگر Taq پلیمراز افزایش حساسیت و دقت PCR می باشد. در دمای پایین
(30 درجه سانتی ­گراد) (که برای DNA پلیمراز E.coli بکار می­رفت) پرایمرها ممکن است به جایگاه هایی که توالی تا حدودی مشابه دارند نیز متصل شوند، زیرا در دمای پایین تعداد کمتری پیوند هیدروژنی برای اتصال پرایمرها نیاز است. بنابراین پرایمرها با اتصال به نواحی نسبتاَ مشابه، باعث ایجاد اشتباه در انجام مراحل PCR می­شوند. ولی وقتی که واکنش در دمای 72 درجه (دمای اپتیمم فعالیت Taq پلیمراز) انجام شود اتصال پرایمر ها به نواحی غیر از ناحِیه­ی اصلی کاهش می­یابد. به این صورت پس از پایان PCR
رشته های DNA کاملاَ مشابه و خالص بدست خواهد آمد. برای دیدن قطعات تکثیر شده DNA می­توان براحتی از الکتروفورز برای ژل آگاروز و رنگ امیزی اتیدیوم بروماید استفاده کرد .