وبلاگ

  نئوسپورا کانینوم تك یاخته اجباری داخل سلولی از شاخه آپی کمپلکسا ، اولین بار توسط برکاس و همكارانش (۱٩۸۴) توصیف شد. دوبی و همكاران (۱٩۸۸) این تک یاخته را برای اولین بار از سگ ها جدا و نامگذاری كردند (Dubey et al. 1988a,b) سپس مشخص شد كه میزبان نهائی نئوسپورا کانینوم، سگ است (Holmdahl and Mattsson 1996; Lindsay et al. 1995  Basso et al. 2001;).

 

نئوسپورورزیس از علل اصلی سقط جنین گاو است، از این رو با سقط ‌، مرده زائی، تولدگوساله ضعیف یا همراه با عفونت دائمی و كاهش تولید شیر ضررهای اقتصادی قابل توجهی ایجاد می كند. انتشار عفونت در گاو با انتقال تاكی زوئیت از مادر به جنین و یا با خوردن آب و غذائی آلوده به اووسیست انگل صورت می گیرد 1999, Trees et al. 1999; Romero et al. 2004) Dubey).

 

مطالعات انجام شده در برخی كشورها حاكی از این است كه ۴۲-۱۳ درصد جنین های سقط شده در گاوها به این انگل آلوده هستند (Dubey and Lindsay 1993; Dubey et al. 2006 ). نئوسپورا کانینوم علاوه بر گاو ، سایر گونه های اهلی چون اسب، گوسفند، بز، شتر، سگ، گربه و سگ سانان وحشی را آلوده می كند (Dubey 2003; Gondinm 2006 ).

 

نئوسپوروزیس انتشار جهانی داشته و از بسیاری از كشورهای جهان گزارش شده است، ایران نیز از این قائده مستثنی نیست. در بررسی آلودگی نئوسپورا کانینوم در گاوهای شیری سقط كرده، رزمی و همكاران (۲۰۰۶) اولین مورد سقط جنین گاوی را در مشهد گزارش كردند و ۱۸/۱۵درصد نمونه های سرمی گاوها در تست  IFAمثبت بودند

 

(et al. 2007; Sadrebazzaz et al. 2004  Razmi).

 

با توجه به گزارشاتی مبنی بر وجود آلودگی در گاوهای كشور و خسارات اقتصادی حاصله بر صنعت گاوداری، طراحی و ارزیابی تستهای تشخیصی حساس و اختصاصی كه توانایی تشخیص حیوانات آلوده را به منظور كنترل نئوسپورا کانینوم در سطح گله داشته باشند ضروری به نظر می رسد.

 

از زمان شناسایی نئوسپورا کانینوم تاكنون روش های تشخیصی زیادی برای شناسایی آلودگی دامها به این انگل ابداع شده است. از این میان می توان به روش های هیستوپاتولوژی، ایمونوهیستوشیمی، سرولوژی، مولكولی، كشت سلولی و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی اشاره نمو د

 

(2003 Dubey and Schares 2006 ; Dubey and Lindsay 1993; Dubey et al. 2006; Dubey )

 

تشخیص قطعی بر اساس آزمایش ایمونوهیستوشیمی بافتهای آلوده است. این روش معمولاﹰ برای تأیید سایر روشها و نیز برای تفکیک نئوسپورا کانینوم از توکسوپلاسما گندئی استفاده شده اما روشی وقت گیر بوده و تفسیر نتایج آن مشکل است

 

 (Dubey and Lindsay 1993; Jones 1996; Romand et al. 1998; Dubey and ;Schares 2006; Dubey 2003).

 

تشخیص آلودگی عمدتا با روش های سرولوژیکی، به عنوان ابزار مهمی برای بررسی های کلینیکی و اپیدمیولوژیکی، انجام می شود (et al. 2007 Silva).

 

آزمایشات سرولوژیک دارای این مزیت هستند که قبل از مرگ دام قابل انجام بوده و اطلاعات کافی در مورد مرحله آلودگی فراهم می سازند (Dubey and Schares 2006). از آنجایی که تنها نشانه در معرض قرار گرفتن با نئوسپورا کانینوم، حضور آنتی بادی های اختصاصی در سرم گاو است، روش های مختلف سرولوژیک برای تشخیص آنتی بادی به کار گرفته شده که شامل  IFAT، انواع الایزا وDAT هستند (et al. 1997 Williams  Romand et al. 1998;  Packham et al. 1998; Paré et al. 1995a;  Lally et al. 1996;  Conrad et al. 1993a;   Björkman and Lunden 1998; ). در این روشها از تاکی زوئیت کامل یا آنتی ژن های مشتق شده از تاکی زوئیت استفاده می شود که به علت واکنش متقاطع با سایر انگلهای مربوطه مانند توکسوپلاسما گندئی باعث واکنش مثبت کاذب می شود

 

(et al. 1993b; Dubey and Lindsay 1993 Conrad et al. 2003; ; 1999 Chahan Bjorkman and Uggla ). همچنین به علت نیاز این آزمایشات به استفاده از مقادیر زیاد آنتی ژنهای مشتق شده از کشت سلولی، اغلب تهیه آنتی ژن و استاندارد کردن آن مشکل است و به دلیل تفاوت در میزان بقایای سلول میزبان بر اختصاصیت و تکرارپذیری نتایج تست تاثیر می گذارد (Lally et al. 1996;  Jiang et al. 2008;  al. 1996;   et Baszler). بنابراین ضروری است که تست تشخیصی مطمئن، حساس و اختصاصی با بهره گرفتن از آنتی ژن های اختصاصی نئوسپورا کانینوم طراحی شود.

 

آنتی ژن های نوترکیب درمقایسه با آنتی ژن های کامل، مزایای بیشتری دارند زیرا اولا به آسانی درحجم زیاد تهیه می شوند و ثانیا به راحتی برای آزمایشات تشخیصی استاندارد می شوند. بنابراین با به كارگیری این آنتی ژن ها، نیازی به آنتی ژن های مشتق شده از کشت سلولی نیست (et al. 2003; Louie et al. 1997  Chahan).

 

تاکنون چندین آنتی ژن نئوسپورا کانینوم شناسایی شده اند که اغلب آنها شامل
پروتئین هایی هستند که روی سطح مراحل مهاجم انگل ظاهر می شوند مانند  NcSAG1و  NcSRS2که از آنتی ژن های سطحی ایمونودومینانت اصلی هستند
(immunodominant surface antigens  major). علاوه بر این ، آنتی ژن هایی نیز هستند که بطور موقتی روی سطح تاکی زوئیت های انگل ظاهر می شوند مانند محتویات میکرونم، راپتری و گرانولهای متراکم. این ها ارگانل های ترشحی در ناحیه قدامی مراحل مهاجم انگل هستند و در واکنشهای فیزیکی مستقیم بین انگل و سلول میزبان نقش دارند
( Soldati et al. 2001; Sonda et al. 2000et al. 1998; Nishikawa et al. 2001a;b;  Liddell Lally et al. 1997;  Boothroyd 2000; Dubremetz et al. 1998; Hemphill et 1997 Black and ).  

 

اگرچه NcSAG1 و  NcSRS2 بطور واضح با همتاهای خود در توکسوپلاسما گندئی (TgSAG1 و TgSRS2) هومولوگ هستند اما میزان تشابه توالی به اندازه ای نیست که باعث بروز واکنش متقاطع شود، از این رو به عنوان مارکرهای تشخیصی عالی برای تمایز موثر بین نئوسپورا کانینوم و توکسوپلاسما گندئی قابل استفاده هستند (Howe et al. 1998). همچنین پاسخهای ایمنی القاء شده توسط این آنتی ژن های سطحی، آنها را به مارکرهای ایده آل برای تشخیص سرولوژیکی آلودگی به نئوسپورا کانینوم و تهیه واکسن تبدیل كرده است

 

Chahan et al. 2003; Gaturaga et al. 2005; Howe et al. 1998; Liu et al. 2007; Pinitkiatisakul et al. 2005 ) Ahn et al. 2003; ).

 

تست الایزا با بهره گرفتن از آنتی ژن های tNcSRS2 -GST و GST-NcSAG1t برای تشخیص نئوسپورا کانینوم طراحی و مورد استفاده قرار گرفته است و نتایج نشان می دهد که این تست، حساسیت و اختصاصیت بالایی دارد و واکنش متقاطعی با سرم مثبت  توکسوپلاسما گندئی ندارد Liu et al. 2007 ; Pinitkiatisakul et al. 2005; Hemphill et al. 1997; l Gaturaga et al. 2005;  Ahn et al. 2003; ).

 

اكثر تستهای تشخیصی به صورت كیت های تجاری وارداتی، پرهزینه و وقت گیرهستند و به مواد و ابزارخاصی نیز نیاز دارند که آن ها را برای کاربرد فیلدی و کلینیکی نامناسب می سازند (et al. 2005  Chahan et al. 2003; Liao )، از این رو طراحی و ارزیابی تست تشخیصی با حساسیت و اختصاصیت بالا كه به ابزار اختصاصی پیشرفته نیاز نداشته باشد و در عین حال سریع و آسان انجام شود ضروری است.

 

 تست لاتکس آگلوتیناسیون LAT)) یکی از راحت ترین تستهای تشخیصی است و در حال حاضر به عنوان یک تست تجاری در دسترس برای

 تشخیص توکسوپلاسما گندئی استفاده می شود ( et al. 2004  Huang). در تحقیقی از تست لاتکس آگلوتیناسیون LAT)) با  آنتی ژن نوترکیب TgMIC3 برای تشخیص سرولوژیکی توکسوپلاسما گندئی استفاده شده که به علت اختصاصیت بالا ، کاربرد سریع و ساده،کم هزینه بودن و مناسب  برای استاندارد شدن، روش تشخیصی مناسبی گزارش شده است (Jiang et al. 2008). تاکنون از این تست برای تشخیص نئوسپورا کانینوم استفاده نشده ولی از آنجایی که TgMIC3 هومولوگ NcMIC3 است و با سرم گاو آلوده به نئوسپورا کانینوم واکنش متقاطع می دهد ) Jiang et al. 2008)، در تحقیق حاضر از NcSAG1 نوترکیب به عنوان آنتی ژن برای تشخیص آنتی بادی ضد نئوسپورا کانینوم در گاو استفاده شد (2005 et al.  Chahan et al. 2003; Liao).

 

هدف از این تحقیق طراحی و استاندارد کردن تست لاتكس آگلوتیناسیون LAT)) بر اساس آنتی ژن نوترکیب   NcSAG1 برای تشخیص سرولوژیکی نئوسپورا کانینوم و مقایسه ی ارزش تشخیصی این تست با کیت تجاری الایزا است.

 

کلیات

 

1-2- تاریخچه

 

 نئوسپورا کانینوم (Neospora caninum)  تک یاخته داخل سلولی اجباری از شاخه آپی کمپلکسا (Apicomplexa) و بسیار شبیه توکسوپلاسما گندئی (Toxoplasma gondii) است. در ابتدا در سگ های نروژی دارای علائم عصبی مانند آنسفالیت و فلجی اندام های حركتی انگلی شبیه به توكسوپلاسما گندئی گزارش شد (Bjerkas et al. 1984). سپس انگل در سال 1987 در گوساله های مبتلا به میلوآنسفالیت مشاهده گردید ( Anderson et al. 2000).

 

در یک مطالعه گذشته نگر مقاطع آسیب شناسی، نشانه های بالینی و اطلاعات آزمایشگاهی ثبت شده از 23 سگ نروژی كه در آنها یک بیماری مانند توكسوپلاسموزیس تشخیص داده شده بود را مورد بررسی و با میكروسكوپ نوری و الكترونی مورد مطالعه قرار دادند. در 13 مورد عامل بیماری توكسوپلاسما گندئی تشخیص داده شد، اما در 10 مورد دیگر از سگ ها یک جنس جدید به نام نئوسپورا و گونه ای به نام نئوسپورا كانینوم كه از نظر ساختمانی و آنتی ژنی متفاوت از توكسوپلاسما گندئی بود، تشخیص داده شد. به این دلیل این انگل نئوسپورا نام گرفت كه از لحاظ سیر تكاملی و ریخت شناسی مشابه با سایر اعضای دسته اسپوروزوآ (Sporozoea) بود و چون برای اولین بار تشخیص داده می شد انگل هاگ دار جدید یا نئوسپورا نام گرفت (2003b; Dubey et al. 1988 Dubey).

 

تا مدت ها سیر تكاملی این انگل كاملاً روشن نبود و میزبان نهایی آن شناسایی نشده بود و تنها حدس زده می شد كه به دلیل شباهت هایی كه با خانواده ساركوسیستیده (Sarcocystidae) دارد باید میزبان نهایی آن یک گوشتخوار باشد. محققین تعداد زیادی از حیوانات و پرندگان را با مرحله كیستی انگل به طور تجربی آلوده كردند، اما نتوانستند اووسیست های انگل را به دست بیاورند و همچنان میزبان نهایی ناشناخته بود تا در یک بررسی اووسیست های انگل از دو قلاده سگ كه به طور طبیعی آلوده شده بودند، جدا شد و سگ به عنوان میزبان نهایی انگل معرفی شد. مدتی بعد نیز اووسیست های این انگل را از مدفوع چند قلاده كایوت جدا كردند و كایوت نیز به عنوان میزبان نهایی انگل مطرح شد
 (Dubey 1992; Haddad et al. 2005 ).

 

از سال 1984 تا كنون شاهد پیشرفت های فراوانی در زمینه یافته های جدید نئوسپورا بوده ایم، به طوری كه تا كنون مقالات زیادی در زمینه های مختلف نئوسپوروزیس از نقاط مختلف جهان منتشر شده است. در ایران نیز اولین بار سقط ناشی از نئوسپورا كانینوم در مشهد توسط رزمی و همكاران (2007) گزارش شد (Razmi et al. 2007 Dubey1999 b; ).

 

2-2– طبقه بندی انگل

 

تک یاخته نئوسپورا کانینوم در شاخه آپی کمپلکسا، رده اسپوروزوا، راسته اوکوکسیدیدا (Eucoccidiidae) ، خانواده سارکوسیستیده، تحت خانواده توکسوپلاسماتینه (Toxoplasmatinae) و جنس نئوسپورا قرار دارد (1999 Hemphill).

 

3-2- سیر تکاملی و ساختمان انگل

 

 نئوسپورا کانینوم انگل دو میزبانه اجباری است (شكل 1-2). سگ و کایوت تنها میزبان های نهایی شناخته شده برای نئوسپورا کانینوم هستند. سگ ها می توانند هم میزبان واسط و هم میزبان نهایی انگل باشند. سیر تكاملی انگل به سه مرحله تاکی زوئیت، برادی زوئیت و اووسیست تقسیم می شود (et al. 2006 Dubey 2003b; Dubey  ).

 

اووسیست‌های انگل به همراه مدفوع میزبان نهایی به بیرون منتشر و در محیط تحت شرایط مناسب (اكسیژن، رطوبت و درجه حرارت) در عرض سه روز هاگ دار می‌شوند. داخل هر اووسیست، دو اسپوروسیست و داخل هر اسپوروسیست، چهار اسپوروزوئیت تشكیل می شود. ابعاد اووسیست‌های هاگ دار حدود 7/11×3/11 میكرون و اسپوروزوئیت‌ها 5/6×2 میكرون است. این اووسیست‌ها شبیه به اووسیست‌های توكسوپلاسما گندئی و هاموندیا هاموندی (Hammondia hammondi) در مدفوع گربه و هاموندیا هیدورنی (Hammondia heydorni) در مدفوع سگ هستند كه جهت تفریق آنها از یكدیگر استفاده از روش‌های ژنتیكی الزامی است (Dubey and Schares 2006 Dubey 2003b;  ).

 

اووسیست‌های هاگ دار انگل همراه با آب و مواد غذایی توسط میزبان‌های واسط خورده می‌شوند. اووسیست‌ها در روده، پاره و اسپوروزوئیت‌ها آزاد شده و پس از ورود به سلول های پوششی روده به تاكی زوئیت تبدیل می‌شوند. تاكی زوئیت‌های هلالی شكل به ابعاد 6×2 میكرون هستند و به سرعت از طریق آندودیوژنی تكثیر می یابند. تاكی زوئیت‌ها، سلول های عصبی، آندوتلیال عروق، سلول های كبدی، ماكروفاژها، فیبروبلاست‌ها، میوكارد و نیز تروفوبلاست‌های جفتی را در حیوانات آبستن مورد تهاجم قرار می‌دهند. همچنین مرحله تاكی زوئیت‌ ممكن است از طریق جفت در حیوانات آبستن به جنین منتقل شود

 

 (Dubey and Lindsay 1993  et al. 2006; Dubey Barr et al. 1993;  ).

 

سیستم ایمنی میزبان مدتی پس از آلوده شدن میزبان واسط بر علیه تاكی زوئیت‌ها كه دارای رشد و تكثیر سریع هستند، تحریک و باعث حذف آنها از بافت‌ها می شود. این مرحله توسط برادی زوئیت‌های 8-7×2 میكرونی كه دارای رشد كندی بوده و در داخل سلول های میزبان، درون كیست‌ها هستند، جایگزین می‌شود. كیست‌های نئوسپورا كانینوم گرد تا بیضی شكل و بیشتر در سلول های عصبی و شبكیه چشم یافت می‌شوند. اندازه کیست های بافتی ممکن است بسته به تعداد برادی زوئیت های داخل آن ها، بسیار متفاوت باشد. کیست های بافتی در سگ ها حدود 107 میکرون قطر دارند و ضخامت دیواره آنها تا 4 میکرون می رسد.
کیست های بافتی در جنین گاو و گوساله هایی که به صورت مادرزادی مبتلا هستند در مغز و طناب نخاعی یافت می شوند. این کیست ها کمی بیش از 50 میکرون قطر دارند و ضخامت دیواره آنها کمتر از 5/2 میکرون است. تعداد کمی از کیست های بافتی با دیواره نازک (1- 3/0 میکرون) در عضلات اسکلتی گاو و سگ هایی که به صورت طبیعی با انگلی شبیه نئوسپورا کانینوم آلوده بودند، گزارش شده است. چنین کیست های بافتی هنوز در حیواناتی که به صورت تجربی آلوده می شوند دیده نشده است. برادی زوئیت‌ها درون كیست‌ها از پاسخ سیستم ایمنی میزبان در امان می‌مانند و به حالت نهفته زندگی می‌كنند، در نتیجه هیچ گونه واكنش ایمنی ایجاد نمی‌كنند. زمانی كه سیستم ایمنی به هر علتی تضعیف شود دوباره به تاكی زوئیت تبدیل می‌شوند (et al. 2006 Dubey 2003b;  Dubey ).

 

برادی زوئیت ها واجد یک هسته انتهایی و تعداد کمی گرانول آمیلوپکتین هستند كه در رنگ آمیزی پریودیک اسید شیف ,(PAS) رنگ قرمز می گیرند. همچنین برادی زوئیت ها را می توان به صورت اختصاصی توسط آنتی بادی اختصاصی برادی زوئیت (BAG-1) از تاکی زوئیت ها تفریق کرد. عمدتاً اعتقاد بر این است که انگل به صورت مرحله برادی زوئیت (کیست های بافتی) در بافت های گاوهای بالغ باقی می ماند. با وجود این، کیست های بافتی تا کنون در مقاطع بافت شناسی از گاوهای بالغی که به صورت طبیعی مبتلا شده اند مشاهده نشده است (et al. 2006 Dubey).

 

تاكی زوئیت‌های موجود در جفت و كیست‌های موجود در بافت های میزبان واسط منبع مهم آلودگی برای سگ‌ها هستند. سگ‌ها 7 تا 15 روز پس از خوردن بافت‌های آلوده میزبان‌های واسط، اووسیست‌های انگل را با مدفوع خود دفع می‌كنند (شكل 2-2). مدت زمان دفع اووسیست‌ها توسط سگ و تناوب آنها به درستی مشخص نیست، هر چند گزارش شده که سگ ها بیشتر از یک نوبت، اووسیست را دفع می کنند (Mcgarry et al. 2003  2003 b;  Dubey).

 

 

 

 

شکل 1-2: سیر تكاملی نئوسپورا کانینوم (19)

در رابطه با توان بقای اووسیست‌ها در طبیعت نیز اطلاعات زیادی در دسترس نیست. مراحل شیزوگونی و گامتوگونی که به نظر می رسد آغازگر تشکیل اووسیست ها در روده سگ هستند تا کنون مشاهده نشده اند. هر چند مراحلی شبیه شیزونت در کشت های سلولی کشت شده با برادی زوئیت های جدا شده از مغز سگ هایی که به صورت طبیعی مبتلا بودند، گزارش شده اند. مطالعات سرواپیدمیولوژیک به اهمیت نقش سگ ها در سیر تكاملی نئوسپورا کانینوم اشاره دارد (et al. 2006 Dubey (.